一、兼并引物（DegeneratePrimer）PCR
（一）模板核酸 PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增，处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当，未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴性。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。 （二）...
所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作 假阴性 ，不该出结果而出了结果我们把它称为 假阳性 。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。 （一）假阴性：出现假阴性结果最常见的原因是：Taq DNA 聚合酶 活力不够，或活性受到抑制； 引物 设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。所...
...需数分钟，所以，一般常取用20～30个周期能使目的DNA达数到百万倍扩增的反应只要数小时即可完成。在基因分离、突变体构建、DNA测序等方面，PCR方法均较之常规法快速的多。例如，用常规方法建立cDNA库或染色体DNA库来分离基因，需花几个月，用PCR方法只需1～2个月星期；用M13法构建突变体需1～2个月，而PCR法只用数天；PCR方法扩增的目的DNA片段可...
...P和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。 （5）DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。 （二）操作程序 过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一...
一、PCR应用特点
1．DNA-PCR定量用同位素标记的探针与电泳分离后的PCR扩增产物进行杂交，根据放射自显影后底片曝光强弱可以对模板DNA进行定量。Abbot等利用这种方法对 人类 T细胞 白血病 反转录基因进行了定量研究。 PCR扩增产物用专为检测ds-DNA而设计的微量荧光计定量，利用染料H33258专与双链DNA结合而使荧光增强50倍的特性。可以从标准模板系列稀释扩增...
一、PCR操作范例
用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法称为复合PCR。这一方法最初是由Chanberlain 等检测人的基因发展而来。Bej等随之发展了对环境样品中不同属细菌相关基因序列同时PCR扩增的检测方法。两种不同的军团菌（legionella）基因，一为特异嗜肺L基因（mip），另一种为L-5SrRNA基因，通过引物摇摆（staggered）添加进行复合PCR。首先...
加端PCR（add-PCR）是使扩增产物的5’-末端加一段DNA顺序的PCR。设计加端PCR的引物时，除与模板配对的那一部分外再加上若干碱基，这样使扩增产物的末端加上额外一段DNA，如加上一个限制酶的识别顺序或特定功能的DNA片段。Stoflet等报道在结构基因前加上噬菌体T 7 的启动子，当然也可用于DNA片段的末端标记或引入特定的点突变。末端可加碱基的数...
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