取HBV质粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl，三蒸水补足体积至10μl，37℃，15min；加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio –11- dUTP各2μl，10×NBt 4μl，三蒸水补足体积至10μl,37℃，15min；三蒸水补足体积至49μl，DNA聚合酶i 5u，混匀，14℃过夜，加0.5mm...
nick translation法,标记DNA 探针 . 缺口翻译法或 切口平移 法是实验室最常用的一种 脱氧核糖核酸 探针标记法。利用 E.coli DNA 多聚酶 I的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新合成的DNA链中从而形成高比活性的均匀标记的DNA探针。线状、 超螺旋 及带缺口的环状双链DNA均可作为 缺口平移 法的模版。 基本原理： 以限量的DN...
（一）基本原理 应用DNA探针缺口翻译（nick translation）方法，通过碱基配对以一条DNA链为模板，将生物素标记的某一种脱氧三磷酸核苷酸如Bio-dUTP渗入有缺口的DNA链。将生物素标记的DNA探针与细胞或组织进行原位杂交。显示方法有二种：一种是用HRP显示，类似免疫电镜技术中采取的包埋前染色法，利用地高辛-过氧化物酶HRP显色法进行光镜水平...
生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上，合成TTP或UTP的类似物。在离体条件下，这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入带有缺口的DNA或RNA，得到生物素标记的核酸探针。这种标记方法称为缺口平移法。用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素...
以HBV DNA为例。取HBv DNA质粒0.5μg，随机引物（Pharmacia）2μg，用TE（pH8.0）补足体积至10μl；100℃，热变性5min，骤冷10min。加10×缓冲液（500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/L MgCl 2 ,10mmol/L β巯基乙醇），BSa 500μg/ml 5μl，5mmol/...
此法是在亚硫酸盐催化下，生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基，使生物素结合到DNA分子上而制成生物素化DNA探针。此法优点是采用通用试剂和技术，检出敏感。Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亚硫酸氢盐存在下可用乙二胺连接臂修饰，此过程也可能介导C-6位的磺酸盐组分。在合适的条件下，可有3%～4%的碱基被修饰。新鲜配制亚硫酸氢钠-乙...
光敏生物素有一个连接臂，一端连接生物素，另一端有芳基叠氮化合物。在可见光照射下，芳基叠氮化合物可能变成活化芳基硝基苯，很易与DNA或RNA的腺嘌呤N—7位置特异结合，大约每50个碱基结合一个生物素，所以只用于标记大于200个核苷酸的片段。光敏生物素的醋酸盐很易溶于水，与核酸形成的共价结合很稳定。此法有以下优点：方法简便易行，快速省时，不需昂贵的酶和dUTP等...
RNA探针比cDNA探针的敏感性提高10倍以上，在许多优点。它们是单链，不需变性，也没有互补链的干扰，与靶基因杂交比DNA探针更稳定。Bio-11-dUTP可通过Sp6、T 3 和T 7 RNA聚合酶掺入到RNA转录子中。标记方法：其下列反应体积为50μl：40mmol/l Tris HCl pH8.0、8mmol/l MgCl 2 、2mmol/L亚精胺、...
在适当的浓度的DNase I作用下在一双链DNA上制造一些缺口，再利用大肠杆菌DNA聚合酶I 的5’—3’外切酶活性依次切除缺口下游的核酸序列，同时将四种脱氧三磷酸核苷（其中一种用放射性标记）利用该酶5’—3’聚合活性补人缺口，使缺口逐个平称并在平移过程中形成标记的新生核酸链。此法也适用于探针的非放射性标记。如 32 P标记DNA探针（缺口平移法）：反应体积...
生物素- 补骨脂 素是另一种生物素光敏物质，在长波长紫外线照射下与嘧啶碱基发生光化学反应，加成到DNA中，去除小分子后，得到生物素标记核酸探针。此法可标记单链或双链DNA或RNA，及寡核苷酸。灵敏度与放射性探针相当。标记方法：取DNA或片段0.5μg加50μlTE（pH8.0）缓冲液中，再加入5μlg生物素- 补骨脂 素，溶解后，置365nm紫外光下直接照射...
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