...内含50mmol/l Tris(pH7.5)、10mmol/l Mg－Cl 2 、10mmol/L β-巯基乙醇和500μg BSA/ml，引物片段1和2各90ng，模板DNA0.1μg,[α- 32 P]dCTp 1.5×10 6 Bq，dATp 、dGTP和dTTP各200μmol/L。标记反应包括3个步骤： （1）变性：反应管在95℃水浴5min，然后...
应用探针DNA上的一个片段作为DNA引物，以环化探针DNA的重组质粒DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，通过变性，退火和延伸过程，使探针DNA得到标记。反应在0.5ml离心管内进行，总体积为25μl，内含50mmol/l Tris—HCl pH7.5, 10mmol/L MgCl 2 、BSa 5mmol/L、80ng引物DNA和0.1μg连接的DNA或0...
（一）概述 基因诊断是以核酸分子杂交技术为基础，在核酸水平检测 人类 遗传性疾病的基因缺陷和一些 传染病 病原体的方法。其基本过程是：制备DNA探针，标记探针，检测样本。开展这项工作的关键是要得到高灵敏度、高特异性的探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来，非同位素标记方法发展很快，已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法，是...
取HBV质粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl，三蒸水补足体积至10μl，37℃，15min；加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio –11- dUTP各2μl，10×NBt 4μl，三蒸水补足体积至10μl,37℃，15min；三蒸水补足体积至49μl，DNA聚合酶i 5u，混匀，14℃过夜，加0.5mm...
以HBV DNA为例。取HBv DNA质粒0.5μg，随机引物（Pharmacia）2μg，用TE（pH8.0）补足体积至10μl；100℃，热变性5min，骤冷10min。加10×缓冲液（500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/L MgCl 2 ,10mmol/L β巯基乙醇），BSa 500μg/ml 5μl，5mmol/...
此法标记原理如下图所示： 标记的HRP部分催化底物化学发光反应：氨基苯二甲酰肼 氨基苯二甲酸 +N 2 +光→X-光片上感光10～20min显定影。 光亮子在酚、萘及胺类等增强剂促进下，而使光亮增强。 这种方法就是利用特殊的酶底物，氧化后把产生的能量转变为光能放出，称为化学发光。杂交后与探针结合的酶催化相应的发光剂，经增强剂将光能放大，在X光片上显示杂交信号...
光敏DNP由一连接臂组成，一端是2，4-二硝基苯，另一端有芳基叠氮化合物。此法适用于含氨基检测基团。其敏感性和光敏生物素标记探针相同，检测时需要抗DNP抗体和免疫化学显色。标记方法：（1）DNA不心变性，必须溶于水中，取2～10μg10μl，加入二甲亚砜25μl，每微克DNA加入光敏DNp 2μg（在避光条件下），混匀。（2）置入冰浴中，在特制灯10cm下照...
聚合酶链反应（PCR）或称体外基因倍增技术，它利用一对位于待扩增的DNA序列两端的取向相对的DNA引物，在DNA聚合酶的介导下，经过多次变性，退火和延伸过程的重复性循环，大量合成靶DNA序列。在标记dNTP存在时，经PCR反应产生的靶DNA片段均参入了标记物，用此法标记的探针标记率高达97.4%。此法重复性好，简便、快速、特异、不要求模板DNA的纯度，可以大...
在0.5ml离心管内进行，反应总体积为50μl，内含模板DNA350ng,DNA引物各50pmol/L,dGTP、dCTP和dTTP各200μmol/L，[α- 32 P]dATp 1.1×10 6 Bq，反应缓冲液为67mmol/l Tris—HCl pH8.8含2.5mmol/l MgCl 2 、6.7mmol/L(NH 4 ) 2 SO 4 、10mm...
此法是在亚硫酸盐催化下，生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基，使生物素结合到DNA分子上而制成生物素化DNA探针。此法优点是采用通用试剂和技术，检出敏感。Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亚硫酸氢盐存在下可用乙二胺连接臂修饰，此过程也可能介导C-6位的磺酸盐组分。在合适的条件下，可有3%～4%的碱基被修饰。新鲜配制亚硫酸氢钠-乙...
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