以质粒或噬菌体作载体进行DNA克隆，在理论上是很简捷的，即用一种限制酶切割质粒DNA，然后在体外与外源，DNA（如干扰素基因，生长激素基因）相连接，再用所得到的重组质粒转化细菌如大肠杆菌，以鉴定重组DNA。 通常所用的质粒载体有pBR322、pUC18、pUC19等，噬菌载体有M13噬菌体载体等。 图24-1 质粒载体的定向克隆 一、质粒或噬菌体载体与外源D...
1．缺口平移 该技术由Kelly等于1970年创立。其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些缺口（nick ）,缺口处会形成3’—羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除。其结果是在缺口平移（nick tr－a...
核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中一项重要技术。目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977年）提出的双脱氧链终止法及Maxam和Gilbert（1977年）提出的化学降解法，其中双脱氧链终止法是目前应用最多，最好的技术。 一、Sanger双脱氧链终止法原理 通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3'-OH...
（一）cRNA探针的同位素标记 1．标记液（转录标记） 2．转录缓冲液 ※：用地高辛或生物素标记时，用UTP替代。 3．标记终止液 4．标记探针水解液 先用dH 2 O悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于60℃条件下反应。 5．探针水解时间 注：L O －探针初始长度（kb） L f －探针的终长度（kb） K－0.11kb/min 6．探针水解终止...
以质粒或噬菌体作载体进行DNA克隆，在理论上是很简捷的，即用一种限制酶切割质粒DNA，然后在体外与外源，DNA（如干扰素基因，生长激素基因）相连接，再用所得到的重组质粒转化细菌如大肠杆菌，以鉴定重组DNA。 通常所用的质粒载体有pBR322、pUC18、pUC19等，噬菌载体有M13噬菌体载体等。 图24-1 质粒载体的定向克隆
DNA 分子 是4种 脱氧核苷 酸经3’→5’ 磷酸二酯 健聚合而成，所以了称为 多核苷酸 （polynucleotide）。DNA的 一级结构 是指4种 核苷酸 的连接及其排列顺序。1953年Watson和Cricd提出了DNA分子双 螺旋结构 模型，其要点是：DNA分子是由2条平行的多核苷酸链围绕同一中心轴构成的右手双螺旋结构（B型DNA）。多种芏酸的方...
单链DNA （single－stranded DNA）大部分 DNA 以双螺旋结构存在，但一经热或碱处理就会变为单链状态。单链DNA就是指以这种状态存在的DNA。单链DNA在分子流体力学性质、吸收光谱、 碱基 反应性质等方面都和双链DNA不同。某些 噬菌体 粒子内含有单链环状的DNA，这样的噬菌体DNA在细胞内增殖时则形成双链DNA。
单链DNA （single－stranded DNA）大部分 DNA 以双螺旋结构存在，但一经热或碱处理就会变为单链状态。单链DNA就是指以这种状态存在的DNA。单链DNA在分子流体力学性质、吸收光谱、 碱基 反应性质等方面都和双链DNA不同。某些 噬菌体 粒子内含有单链环状的DNA，这样的噬菌体DNA在细胞内增殖时则形成双链DNA。
RNA探针比cDNA探针的敏感性提高10倍以上，在许多优点。它们是单链，不需变性，也没有互补链的干扰，与靶基因杂交比DNA探针更稳定。Bio-11-dUTP可通过Sp6、T 3 和T 7 RNA聚合酶掺入到RNA转录子中。标记方法：其下列反应体积为50μl：40mmol/l Tris HCl pH8.0、8mmol/l MgCl 2 、2mmol/L亚精胺、...
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