...（6）PBS冲洗2×3min。 （7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。 （8）2×SSC冲洗10min。 （9）杂交：如是cDNA探针用前需进行变性处理，载片法时将切片在空气中晾干，加含探针的杂交液10μl于切片上，盖上22×22mm的硅化盖片或相当大小看蜡膜， 3 H标记探针每10μl杂交液含1×10 5 cpm探针， 32 P...
1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其...
1．杂交膜的选用杂交膜是一种多孔、表面积很大的固相载体，核酸一旦固定在上面，就可用杂交法进行检测。最常使用的膜是硝酸纤维素膜，用于放射性和非放射笥标记探针都很方便，产生的本底浅，与核酸结合的化学性质不是很清楚，推测为非共价键结合。经80℃烤干2h和杂交处理后，核酸仍不会脱落。硝酸纤维素膜的另一特点是只与蛋白有微弱非特异结合，这在使用非同位素探针中尤为有用。硝...
...H值调至7.0，补足ddH 2 O至1000ml，加入终浓度为0.1%～0.2%的DEPC，分装后高压灭菌，可室温保存。 该液主要用于配制予杂交液及杂交后的各种洗脱液，以保持一定的离子强度。此外，在用于杂交的湿盒内也常用5×的SSC以保持一定湿度。 2．Denhardt’s液 通常配成10×，50×或100×的储备液 配制：称取上述试剂，溶于800ml左右灭...
检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度，在复杂的物体中，使无法感觉的特定物质进入 人类 的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来已有二十年，目前研究实验室用得多，临床实验室用得较少，除成本高外，关键是操作复杂，重复性差，仅能半定量。成本高可随经济发展而缓和，但其它缺点尚需努...
...EPC处理过的灭菌蒸馏水。 DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO 2 和...
原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry, ISHH）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在核酸原有的位置进行细胞定位。这一技术为研究单一细胞中编码各处蛋白质、多肽的相应mR...
1．蛋白酶 （Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临...
原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry, ISHH）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在核酸原有的位置进行细胞定位。这一技术为研究单一细胞中编码各处蛋白质、多肽的相应mR...
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