...。反应需有Mg2+和ATP存在,pH7.5-7.6。最适温度37℃,30℃以下活性明显下降,但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端的退火温度,一般平端连接用20-25℃,粘端连接用12℃左右。聚合酶有DNA聚合酶(以DNA为模板合成DNA...
...Dahlen 等利用微孔板进行夹心杂交,可同时进行大量样品检测,他们先吸取DNA探针加到凹板中,然后用紫外线照射使其固定到塑料板上。用微孔板进行夹心杂交还可直接用于PCR技术。应用光敏生物标记探针检测PCR产物的敏感性和用32P标记探针(3×...
...清楚的DNA或需确定DNA带的特异性时,可用标记的公用混合探针和(或)型特异探针作Southern吸印杂交、斑点杂交验证。按照标准方法制32p ATP标记的寡核苷酸探针,需达到约107cpm/pmol特异活性。杂交液中需含有2×106-5×...
...’→3外切酶活性,也不能用单链DNA作为模板。2.噬菌体DNA聚合酶这里以T4DNA聚合酶为例。它也具有5’→3聚合酶活性,但它的外切酶活性比大肠杆菌的要高200倍。因此,它也可用来补齐单链末端或标记同位素。(二)RNA聚合酶RNA聚合酶(...
...最多,最好的技术。一、Sanger双脱氧链终止法原理通常DNA的复制需要:DNA聚合酶,单链DNA模板,带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物,4种dNTP(dATP、dGTP、dTTP和dCTP)。聚合酶用模板作指导,不断地将dNTP加到...
...DNA切开,电泳分离,再变性,印迹到硝酸纤维(Nc)滤膜上,用探针进行杂交,检测DNA的方法。自显影或显色用于DNA分析。以32P标记放射性探针为例,放射自显影观察结果。(图18-6)。图18-6 Southernblot体系前述分离、纯化的...
...在暗盒中日光进行放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带,基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变。分子杂交是基因探测的基础,除了用印迹杂交外,还有斑点杂交法。即将DNA样品变性后直接点在硝酸纤维滤膜上,再...
...的DNA已足以开始聚合酶链反应。基因探针用于在一个特定染色体上确定一个特殊基因的位置。当有放射活性的原子加入已被克隆或复制的基因,此克隆或复制的基因则成为一个被标记的探针。这个探针将找出它的DNA镜像节段,并与之结合。放射活性探针能被精密...
...应用领域逐渐扩大并在两个主要进行了技术法的改进。一方面是应用一系列放大手段增强检测的灵敏度(详见二十二章 ),另一方面是提高其分辨率,即向电镜水平发展。Jacob(1971)首先用3H标记的核酸RNA探针与DNA杂交并在电镜水平显示获得成功,...
...原位杂交术(in situ hybridization)是一种核酸分子杂交技术,它是通过检测细胞内mRNA和DNA序列片段,原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基图1-11 大鼠肝大部切除后再生过程中增殖期肝细胞摄取3H标记的胸腺嘧啶核苷...
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